---

Anexo 2

ANEXO 2 - EXEMPLOS E QUADROS PARA AS MEMÓRIAS DE CÁLCULOS NAS HIBRIDIZAÇÕES IN SITU

Quadro 1. Descrição do material, tipo de sonda e resultados obtidos.

Responsável: _________________________________________ Data: __/__/__.
Lâmina Nº	Material	Sonda	Resultado
01	Acesso 26799	Centeio/01 - FITC (Mistura 1 – M1)	Deve ser informado após as hibridizações para se ter uma memória dos experimentos
02	OCT 97	Centeio/08 - Dig (M2)
03	PF 838197	Centeio/08 - Dig (M2)

 

Quadro 2. Memória de cálculo para a mistura de hibridização.

Responsável: ___________________________________________ Data: __/__/__
Componente	Quantidade (µL)	Total	Mistura
			1	2
Formamida 100%	2,5	7,5
Dextran sulfato 50%	1	3
20x SSC	0,5	1,5
Subtotal	-	12	4	8
Sonda + bloqueio + H2O	1		0,5 Bloqueio	1 Bloqueio
			0,5 Sonda	1 Sonda
Total	5		5	10

 

Quadro 3. Descrição dos anticorpos e antianticorpos caso a marcação seja indireta.

Conjunto	Anticorpo	Quantidade por lâmina (µL)		Número de Lâminas1	Total por conjunto (20 µL)
		Anticorpo1	BSA 1%		Anticorpo	BSA 1%
1º	Mouse anti-biotin	1	19	-	-	-
	Sheep anti-digoxigenin	0,4	19,6	2	0,8	39,2
	Mouse anti-bio + Sheep anti-dig	1 + 0,4	18,6	-	-	-
2º	Anti-mouse-TRITC	0,7	19,3	-	-	-
	Anti-Sheep-FITC	0,5	19,5	2	1	39
	Anti-mouse-TRITC + Anti-Sheep-FITC	0,7 + 0,5	18,8	-	-	-

¹ A concentração dos anticorpos deve seguir a recomendação do fabricante. Por exemplo, para reconhecer a biotina, a recomendação do fabricante para diluição da antibiotina é de 1:20, ou seja, deve-se adicionar 1 L de antibiotina em 19 L de BSA 1% em 4x SSC + 0,1% Tween 20. Para estreptavidina CY3, o fabricante recomenda uma diluição de 1:100 (para uma solução de 20 L, usar 2,0 L de estreptavidina + 19,8 BSA 1% em 4x SSC + 0,1% Tween 20). No caso de avidina FITC, o fabricante recomenda 1:50 (para uma solução de 20 L, usar 0,4 L de anticorpo + 19,8 BSA 1% em 4x SSC + 0,1% Tween 20).
² Número de lâminas hibridizadas com sondas de marcação indireta.

 

Quadro 4. Percentagem de estringência de DNA:DNA para sondas com 43% de conteúdo GC e com aproximadamente 300 pb.

SSC	Formamida % (na solução final)
	60	55	50	45	40	35	30	25	20	15	10	5	0
(A) 37 °C
5 X	76	73	70	67	64	61	58	55	52	49	46	43	40
2	83	80	77	74	71	68	65	62	59	55	52	49	46
1	88	85	82	79	76	73	70	67	64	60	57	54	51
0,75	90	87	84	81	78	75	72	69	66	63	59	56	53
0,5	93	90	87	84	81	78	75	72	69	65	62	59	56
0,2	100	96	93	90	87	84	81	78	75	72	69	66	63
0,1	105	101	98	95	92	89	86	83	80	77	74	71	68
(B) 42 °C
5 X	81	78	75	72	69	66	63	60	57	54	51	48	45
2	88	85	82	79	76	73	70	67	64	60	57	54	51
1	93	90	87	84	81	78	75	72	69	65	62	59	56
0,75	95	92	89	86	83	80	77	74	71	68	64	61	58
0,5	98	95	92	89	86	83	80	77	74	70	67	64	61
0,2	105	101	98	95	92	89	86	83	80	77	74	71	68
0,1	110	106	103	100	97	94	91	88	85	82	79	76	73

Fonte: Schwarzacher & Heslop-Harrison, 2000 (para maiores detalhes ver Capítulo 7 – Stringency and kinetics).