Dezembro, 2009	119
		Passo Fundo, RS

Microscopia óptica

Para estudos morfológicos, as fêmeas de primeira geração (hermafroditas), as fêmeas de segunda geração e os machos são obtidos através da dissecação dos insetos infectados após 3-4 dias para as fêmeas hermafroditas e 6-7 dias para fêmeas anfimíticas e machos, após a morte do inseto. Os JIs de terceiro estádio são obtidos durante os dois primeiros dias após a emergência destes dos cadáveres dos insetos (NGUYEN et al., 2006; NGUYEN & SMART, 1995a). São comumente usadas larvas de insetos da espécie G. mellonella ou T. molitor.

Para microscopia de luz, pelo menos 20 machos e fêmeas (20 para cada estádio) e 25 juvenis infectantes devem ser examinados. Os Neps são mortos e fixados em TAF como sugerido por Courtney et al. (1955) e espécimens adicionais são transferidos para lactofenol (FRANKLIN & GOODEY, 1949), a fim de que estruturas morfológicas sejam melhor observadas. Os nematoides fixados em TAF são colocados em glicerina utilizando o método de Seinhorst (SEINHORST, 1959). Suportes para lamínula são usados em todos os casos para evitar achatamento dos espécimens (Fig. 22).

As medidas a serem observadas em juvenis infectantes são:

L = comprimento total do corpo;

W = maior largura do corpo;

NR = distância da extremidade anterior ao anel nervoso;

EP = distância da extremidade anterior ao poro excretor;

ES = comprimento do esôfago;

T = comprimento da cauda;

ABW = largura do corpo na altura do ânus;

Hyaline = porção entre a cutícula interna e a externa.

Usam-se também os seguintes índices:

D (%) = (EP/ES);

E (%) = (EP/T);

H/T (%) = (Hyaline/T);

a = (L/W);

b = (L/ES);

c = (L/T).

Nas fêmeas de primeira e segunda geração, as medidas são:

L;

W;

NR;

EP;

ES;

ABW;

T;

STW = largura do estoma;

STL = comprimento do estoma;

V = distância da vulva à extremidade anterior;

V (%) = distância da porção anterior à vulva/tamanho do corpo x 100.

As medidas morfométricas em machos são:

L;

W;

NR;

EP;

ES;

ABW;

T;

SP = tamanho da espícula;

SW = maior largura da espícula;

GU = comprimento do gubernáculo (Fig. 22A);

TR = testículo reflexo;

D%;

SW (%) = SP/ABW;

GS (%) = GU/SP.

A morfologia da bursa é determinada apenas para espécies do gênero Heterorhabditis. Os machos são transferidos para um disco com lactofenol em uma chapa aquecida a 65-70 ºC. Após 30 minutos, um macho é transferido para uma gota de lactofenol em uma lâmina. A parte anterior do macho é removida e, em seguida, uma lamínula é colocada sobre a gota de lactofenol contendo a parte posterior do nematoide, observando-se dez machos (NGUYEN et al., 2004). A quantidade e distribuição das papilas na bursa são características usadas para diferenciação de espécie (Fig. 23).

Microscopia eletrônica de varredura

Adultos e JIs de Neps são fixados em glutaraldeído 3% com 0,1 M cacodilato de sódio, pH 7,2 por 24 h a 8 ºC. Os Neps são pós-fixados em solução de tetróxido de ósmio a 2% por 12 h a 25 ºC, desidratados em etanol, obtendo-se o ponto crítico com CO2 líquido. Posteriormente são montados em suportes para microscopia e cobertos com ouro (NGUYEN & SMART, 1995b). As imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura possibilitam melhor visualização das estruturas externas do corpo do Nep, auxiliando na comparação e diferenciação entre nematoides (Fig. 24).

Documentos Online Nº 119 Publicações Online

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