Dezembro, 2009	119
		Passo Fundo, RS

Extração de DNA

O DNA é extraído de uma fêmea hermafrodita ou JIs como descrito por Nguyen et al. (2001). Para isso, estes são macerados em 20 µL, quando fêmea, e 10 µL, quando juvenil infectante, de suspensão composta por 50 mM de KCl, 10 mM de Tris pH 8,3, 2,5 mM de MgCl2, 0,45% de NP04, 0,45% de Tween 20, 0,01% de gelatina e 60 µg/mL de proteinase K e transferidos 0,5 mL para microcentrífuga. Esses tubos são congelados a -80 °C por 10 minutos, depois incubados a 65 °C por 1 hora e posteriormente incubados em 95 °C por mais 10 minutos. Esses processos são feitos para completar a quebra das células, a digestão de proteínas e para inativar a proteinase K, respectivamente. Em seguida, os tubos são colocados em gelo e centrifugados em 12.000 rpm por 2 minutos. Coleta-se o sobrenadante com o DNA e mantém-se a 4 °C para uso subsequente (NGUYEN et al., 2001).

Amplificação de PCR

O próximo passo a ser seguido é a amplificação de PCR, na região ITS do DNA ribossomal.

A amplificação do PCR é feita usando os “primers”:

18S: 5_-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3_ (frente) e

26S: 5_-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3_ (reverso).

Os “primers” internos usados são:

58P = 5'-ACGAATTGCAGACGCTTAG-3' (frente) e

H58R = 5'-GTGCGTTCAAAACTTCACC-3' (reverso) (NGUYEN et al., 2004).

A região ITS é amplificada em uma reação usando 100 µL do kit DNA polimerase.

Para completar a reação, são usados 10 µL de 10x suspensão de PCR (composta por 100 mM Tris-HCl (pH 8,8), 15 mM MgCL2, 500 mM KCl, 1% Triton X-100), adicionado de 2 µL de dNTP, 2 µL do “primer” à frente, 2 µL do “primer” oposto, 0,5 µL de Thermalase Thr, 74 µL de água destilada e 10 µL do extrato do DNA.

As reações são conduzidas em ciclos padrões:

1 ciclo de 94 ºC por 7 minutos seguido de

35 ciclos a 94 ºC por 1 minuto; posteriormente

1 ciclo a 45 ºC por 1 minuto,

1 ciclo de 72 ºC por 1 minuto e

1 ciclo de 72 ºC por 10 minutos.

Estes ciclos devem ser ajustados de acordo com o Nep em que se deseja a amplificação do DNA (NGUYEN et al., 2004).

Sequenciamento

Após a amplificação, é feito o sequenciamento. Os produtos do PCR são sequenciados bi-direcionalmente. O produto do sequenciamento é precipitado em etanol a fim de remover “primers” e nucleotídios não incorporados. Para isso, 1 µL de acetato de sódio 3 M, pH 4,06 e 25 µL de etanol a 95% são adicionados a 10 µL da reação sequenciada, incubando em gelo por 10 minutos e centrifugando em microcentrífuga por 15 minutos. O pelete é lavado com etanol a 70% e seco em dessecador a vácuo.

As sequências completas da região ITS são alinhadas usando “software” para alinhamento Clustal X (THOMPSON et al., 1997) e, então, ajustadas manualmente, usando MacClade 4.05 (MADDISON & MADDISON, 2002).

Análise filogenética

Análises filogenéticas podem ser feitas usando PAUP, (Phylogenetic Analysis Using Parsimony), conforme Swofford (2002). Para análise de parcimônia, as árvores mais curtas são obtidas usando “branch and bound algorithm”. Caenorhabditis elegans e Pellioditis typica são espécies usadas como grupo externo ao táxon e raiz da árvore.

Documentos Online Nº 119 Publicações Online

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