Dezembro, 2009	119
		Passo Fundo, RS

Para se proceder à inoculação de Neps em insetos ou substratos, deve-se usar JIs multiplicados recentemente, de preferência com menos de 15 dias e um máximo de um mês após a purificação. Os passos principais no preparo de inóculo são:

Multiplicação

A multiplicação feita em insetos consiste em se aplicar uma suspensão de JI em papel colocado como base sobre o fundo de placa de Petri em volume suficiente para umedecer completamente o papel (Fig. 13). Diversos insetos podem ser usados para a multiplicação de Neps. O mais usado nos laboratórios de patologia de insetos são as lagartas de G. mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae), por sua ampla suscetibilidade aos Neps e alta multiplicação de JIs. Outro inseto comumente empregado é a larva de T. molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae), por seu manejo mais simples e facilidade de aquisição. No entanto, existem nematoides que não se multiplicam bem nesses dois insetos. Steinernema scapterisci, S. kushidae e S. scarabaei são exemplos.

A quantidade indicada de JIs aplicada por larva está em torno de 20. A adição de muitos JIs acaba proporcionando menor número de progênies devido à competição por alimentos ou contaminação com bactérias externas.

Usa-se a quantidade de larvas suficiente para obter o número previsto no inóculo. Uma larva de G. mellonella pode sustentar a produção de mais de 10.000 JIs, podendo ultrapassar 100.000.

Deixa-se a placa incubando por cerca de quatro dias, e colocam-se as larvas mortas em armadilha de White, para recolher os JIs produzidos. A temperatura indicada é de 23 a 25 ºC.

Os insetos não devem ficar em contato direto com a água, para não ocorrer anoxia e, consequentemente, apodrecimento. Por outro lado, se durante o tempo de incubação o nível de água diminuir muito, deve-se ter o cuidado de se adicionar água apenas na base da placa e nunca diretamente no inseto, pois, além de favorecer apodrecimento nas fases iniciais, pode conduzir para a água, outras fases dos Neps que não os juvenis infectivos. Se isso ocorrer, devem ser separados os JIs dessas outras fases, por peneiramento, por filtragem em papel ou por retirada direta, pois essa mistura não é desejável na produção de inóculo, bem como para manutenção da coleção. As outras fases, além de não servirem para infectar insetos e atrapalharem na contagem, morrem rapidamente, afetando a sobrevivência dos JIs pela decomposição de seus corpos.

Purificação

Após 10 a 15 dias começam a aparecer os primeiros juvenis infectivos na água (Fig. 14).

Considera-se que os JIs obtidos na primeira semana após o início da liberação deles na armadilha de White são mais vigorosos e preferíveis para uso nos testes e para conservação. No entanto, os JIs podem continuar saindo dos insetos por cerca de duas semanas. Os JIs encontram-se em uma suspensão de resíduos dos insetos e bactérias, e por isso devem ser retirados dela. Coletam-se os JIs de uma placa de Petri de 90 mm de diâmetro em um becker de 80 ml e adiciona-se água para diluir a suspensão (Fig. 15). Deixa-se de meia a uma hora. Verificada a sedimentação dos JIs no fundo do recipiente, elimina-se cuidadosamente o sobrenadante e se repete o processo de diluição, precipitação e eliminação do sobrenadante por mais duas vezes.

Pode-se, também, fazer um processo rápido, que é o de peneiramento, usando-se tamanho adequado para não se perder os JIs. Peneiras de 500 mesh são seguras, mas há nematoides que são retidos em 325 mesh ou menos. O peneiramento é menos prático quando se necessita trabalhar com muitos isolados ao mesmo tempo e pode, além disso, causar contaminações entre estirpes, devido à insuficiente eliminação de uma estirpe filtrada imediatamente antes. O uso de água com temperatura superior a 70 ºC é indicada para matar os nematoides restantes nos recipientes usados.

Contagem

A contagem direta é feita sob lupa, usando-se repetições, para fugir da variabilidade de tomada da amostra. Uma forma rápida para obter a concentração de Neps de uma suspensão é a descrita a seguir.

Com pipeta de deslocamento ativo, distribuem-se sete gotas de 20 µL sobre uma tampa de placa de Petri (Fig. 16). Indica-se usar concentrações ajustadas previamente por diluições aleatórias para obter-se cerca de 30 JIs por gota. Em microscópio estereoscópico conta-se o número de JIs de cada gota, descarta-se o número maior e o menor, e calcula-se a média das cinco gotas restantes. Por regra de três, calcula-se o volume de suspensão necessário para a inoculação de cada parcela ou inseto: concentração inicial x volume inicial = concentração final x volume final.

Para se ter uma boa aproximação, deve-se ter os cuidados de se eliminar a água que fica aderida externamente à ponteira e se proceder a uma rigorosa homogeneização. A melhor homogeneização para JIs em suspensão é conseguida por retorno, usando-se dois recipientes. Para a primeira tomada de amostra para a contagem, fazem-se quatro retornos. Para as gotas seguintes, basta um retorno. Em um copo de becker pequeno, é necessário ter pelo menos 5 mL de volume para o procedimento. Caso se disponha de menor quantidade de suspensão de nematoides, pode-se usar pipeta, aspirando e ejetando a suspensão antes de cada gota amostrada.

As técnicas acima podem ser visualizadas no vídeo “Metodologias usadas na Embrapa Trigo para obtenção e manutenção de nematoides entomopatogênicos” (VOSS, 2009) .

Documentos Online Nº 119 Publicações Online

Copyright © 2009, Embrapa Trigo