Dezembro, 2009	119
		Passo Fundo, RS

Câmara com temperatura controlada

Muitas espécies de nematoides provenientes de regiões mais quentes podem morrer em temperatura de geladeira comum. Assim, estes nematoides deverão ser colocados em câmara com temperatura de 10 ºC, podendo ser usado até 15-16 ºC com conservação por período de 2 a 3 meses em garrafas de cultura de tecido (Fig. 8). Em geral, Steinernema é mais tolerante ao frio do que Heterorhabditis. Adicionalmente, pode-se utilizar esponja de poliuretano (Fig. 8), cujas condições de superfície específica e de aeração e umidade podem ampliar o tempo de sobrevivência (BARBOSA-NEGRISOLI et al., 2009).

As esponjas podem ser mantidas também em sacos plásticos. Para a recuperação dos JIs, as esponjas são imersas em água e pressionadas. Esse método pode ser utilizado como um tipo de formulação de Neps ativos e permite o envio de JIs em condições adequadas de aeração e umidade.

O transporte ou envio postal dessas esponjas pode ser feito por poucos dias em isopor em temperatura ambiente, sem comprometer a qualidade do inóculo. Os sacos com as esponjas devem ser embalados após climatização à temperatura ambiente, para evitar que a expansão da atmosfera interna causada pelo aumento da temperatura abra os sacos durante o transporte e provoque perdas e contaminações.

Criopreservação

A criogenia consiste na manutenção dos nematoides abaixo de 130 ºC negativos, em nitrogênio líquido, para conservação de estoque-mestre para longa duração (Fig. 9).

Os procedimentos descritos a seguir seguem Popiel & Vasquez (1991), modificado por Nugent et al. (1996), e com adaptações às condições de operação do laboratório de Patologia de Insetos da Embrapa Trigo:

1. Misturar vigorosamente igual quantidade de suspensão de nematoides e solução de glicerol a 28%, ou a 34%, e incubar por 72 horas a 23 ºC, para obter concentrações finais de 14% ou 17%.

Para muitas estirpes de origem tropical, a concentração final de 14% de glicerol permite maior recuperação de JIs criopreservados do que a de 17%. Um pré-teste pode ser feito verificando-se a sobrevivência após 24 horas em criopreservação.

2. Verter a suspensão sobre disco de papel Whatman n. 42 ou Whatman n. 1 sobre funil de Buchner submetido à sucção através de Kitasato conectado à bomba de vácuo (Fig. 10). A deposição da suspensão sobre o filtro deve ser feita lentamente, de modo a evitar extravasamento pelas bordas do mesmo.

3. Verter metanol 70%, mantido a 23 ºC, sobre os Neps retidos no papel na operação anterior, para remover o excesso de glicerol, utilizando sucção.

4. Colocar o papel filtro com os nematoides em 5 mL de metanol 70% à temperatura aproximada de 5 ºC, em placa de Petri de 60 mm de diâmetro, imersa parcialmente no gelo.

5. Deixar por 10 minutos.

6. Retirar o papel filtro de modo a deixar escorrer o metanol do papel, para deixar a maior parte dos JIs na placa.

7. Agitar e colocar 1 mL da suspensão sobre um disco de papel filtro de 2 cm diâmetro, sobre funil de Buchner, para retirar o excesso de metanol, por sucção.

8.Transferir o disco de papel com os JIs para criotubo de 2-3 mL com tampa provida de anel de silicone. Essa quantidade de suspensão trabalhada permite fazer quatro criotubos. Enquanto completa a operação de acondicionamento de Nep no papel filtro, deixar o criotubo pronto mergulhado no gelo ou em nitrogênio líquido.

9.Colocar os criotubos em suporte adequado e inserir no botijão de nitrogênio líquido (Fig. 11).

10. Anotar a data da operação e a localização das amostras.

11. Para descongelar, abrir o criotubo, adicionar 1-2 mL de água ou solução salina com temperatura entre 23 ºC a 30 ºC. Colocar o tubo aberto dentro da placa de Petri com cerca de 15 mL de água ou solução salina, a 23ºC, por 24 horas. A rapidez do descongelamento a partir da retirada do criotubo do botijão de nitrogênio líquido é crítica, pois os nematoides vão perecendo à medida que o tempo de descongelamento se prolonga acima de 45 segundos (NUGENT et al., 1996).

Manutenção de Neps pela obtenção de isolinhas

Os isolados de Neps constituem uma população que pode conter variantes, sujeitas a uma seleção inadvertida, por multiplicações sucessivas ou por alterações ao longo do tempo por adaptação às condições de laboratório (HOPPER et al., 1993; WANG & GREWAL, 2002). A produção de isolinhas a partir dessas populações constitui uma forma de conservação de Neps porque tem como princípio manter populações de Neps geneticamente homogêneas. Com as isolinhas, corre-se menor risco de alterações de características dos Neps pelo manuseio e multiplicação em laboratório.

Os procedimentos baseiam-se em provocar cruzamentos entre Neps irmãos e são diferenciados conforme o gênero de nematoide, porque o gênero Heterorhabditis tem a sua primeira geração de fêmeas hermafroditas, diferenciando-se em macho e fêmea apenas a partir da segunda geração, enquanto Steinernema tem JI anfimítico, levando ao cruzamento de macho e fêmea desde a primeira geração.

Obtenção de linhas endogâmicas em Heterorhabditis

In vivo: infectar inseto suscetível com apenas um juvenil infectivo do isolado selvagem, coletar os novos JIs produzidos de cada cadáver de inseto e reinfectar outros insetos sucessivamente, sempre inoculando apenas um JI por inseto (BAI et al., 2005). Como é difícil conseguir infecção com apenas um JI, há necessidade de se usar vários insetos para garantir a obtenção de larva infectada. Com 10 passagens por insetos é possível obter-se em torno de 95% de homozigose.

In vitro: colocar um JI esterilizado superficialmente e inoculado em Meio de Crescimento de Nematoide (NGM), (Anexo), semeado previamente com sua bactéria simbiótica Photorhabdus para alimentar o nematoide. Após 72 horas, transferir juvenis do quarto estágio ou fêmea virgem, individualmente, para nova placa com meio de cultura. Como são hermafroditas, esses indivíduos se reproduzirão por autofecundação (GLAZER et al., 1991). Repetir essa multiplicação por, pelo menos, sete vezes.

Obtenção de isolinhas com Steinernema

Deve-se partir de um adulto macho e de uma fêmea virgem em meio de cultura e promover o cruzamento entre irmãos nas progênies seguintes, como nos procedimentos descritos acima para cruzamentos de Heterorhabditis, in vitro.

Caracterização das isolinhas obtidas

Com a homozigose, características recessivas podem se manifestar, levando a fenótipos diferenciados. Por isso, devem ser conduzidas diversas linhas de uma mesma população selvagem, simultaneamente, para poder selecionar características de interesse para o controle biológico, como o de sobrevivência em condições adversas (temperatura, raios ultravioleta e dessecação), capacidade infectiva, capacidade de multiplicação e virulência (SHAPIRO-ILAN et al., 1996). Pesquisas feitas por Wang & Grewal (2002) sobre essas características mostraram que, uma vez fixadas, não houve alteração do comportamento das isolinhas durante o período de um ano em que foram monitoradas. Técnicas para testes específicos podem ser encontradas em Wang & Grewal (2002).

Documentos Online Nº 119 Publicações Online

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