Embrapa Trigo


		Dezembro, 2009	119
		Passo Fundo, RS

II Técnicas para obtenção, conservação e seleção de nematoides entomopatogênicos

Isolamento de bactérias simbióticas de nematoides entomopatogênicos

Além de produzirem toxinas para matar os insetos, as bactérias entomopatogênicas produzem antibióticos, que lhes permitem crescerem, no inseto, livres de outras bactérias e fungos. As bactérias também sintetizam diversas enzimas extracelulares, pigmentos com ou sem bioluminescência e inclusões cristalinas que são de interesse biotecnológico. Na multiplicação in vitro de nematoides, como a necessária para a produção de isolinhas e produção de inoculante comercial, as bactérias são adicionadas ao meio de desenvolvimento dos Neps, servindo de alimento para estes. Para estudos genéticos e biotecnológicos e para produção in vitro de Neps, as bactérias podem ser isoladas partindo-se de um único JI ou de um grupo de JIs.

A seguir, descreve-se o procedimento rápido de isolamento, desenvolvido na Embrapa Trigo, que parte de um grupo de 100 a 200 JIs. Em câmara de fluxo laminar, coloca-se uma suspensão concentrada de 50 µL de juvenis infectivos de Neps em solução de 50 µL de hipoclorito de sódio a 2%, em placa esterilizada, deixando-se por 5 minutos para promover a assepsia externa dos JIs. Com a ajuda de micropipeta, provoca-se a ressuspensão da mistura e transfere-se 50 µL para gota de água deionizada e esterilizada de mesmo volume. Mistura-se a suspensão aspirando e retornando com micropipeta, distribuindo-se imediatamente sobre a superfície de meio de cultura Ágar Nutriente (Anexo) em placa de Petri. As placas são incubadas a 23 °C, em câmara DBO, até o aparecimento de colônias formadas pelas bactérias que o nematoide liberou (Fig. 12).

O isolamento segue os procedimentos de bacteriologia e a manutenção das bactérias pode ser feita inoculando-se cerca de 50 µL de cultura do isolado em 5 mL de Caldo Nutriente (Anexo) com 17 % de glicerol, colocando-se imediatamente a 70 ºC negativos. Para uso frequente, pode-se manter as bactérias em meio de cultura sólido Ágar Nutriente, em bisel, a 12 ºC-15 ºC, refazendo-se mensalmente a cultura.

Documentos Online Nº 119 Publicações Online