Dezembro, 2009	119
		Passo Fundo, RS

Os testes para determinar a virulência de Neps sobre os insetos em laboratório podem ser conduzidos em papel filtro, sobre recipiente adequado, ou com os insetos imersos em areia ou em solo. Os substratos podem ser ou não esterilizados, conforme o objetivo dos testes.

Substrato

Testes preliminares de virulência podem ser feitos aplicando-se os Neps em papel filtro ou papel germiteste no fundo de placa de Petri (Fig. 17) ou de outro recipiente. Substratos como areia e solo são usados geralmente para os biotestes seguintes.

A areia normalmente é usada esterilizada, quando se objetiva obter resultados isentos da interferência de outros organismos.

O solo pode ser usado esterilizado ou sem esterilização. A não ser para casos de estudos específicos, a preferência de substrato para os biotestes de virulência de Neps para insetos de solo recai sobre o solo não esterilizado, pois este mimetiza as condições que o nematoide vai encontrar a campo, incluindo a exposição a predadores (Fig. 18). Deve-se lembrar que a esterilização produz alterações no solo, podendo levar a aumento na disponibilidade de elementos a níveis potencialmente tóxicos.

O solo deve ser umedecido à capacidade de campo ou menos, para permitir o deslocamento e sobrevivência dos Neps. A porcentagem de umidade do solo com base no peso do solo não é uma referência adequada, pois a capacidade do solo de manter água varia com a textura e composição mineralógica. Por exemplo, a capacidade de campo pode ser de 35% em solo argilosos e apenas 12% em solo arenoso. O próprio conceito de capacidade de campo é vago: a grosso modo, capacidade de campo é aquela que o solo atinge três dias após uma chuva, ou seja, em que os macroporos ficam sem água, e os microporos ficam cheios, proporcionando aeração e umidade, simultaneamente. Assim, em trabalhos de pesquisa em que o conteúdo de água tem valor decisivo, deve-se determinar, em laboratórios especializados, a curva de retenção de água, que define mais precisamente o conteúdo de água do solo e as forças matriciais e osmóticas de retenção da água. Em ensaios preliminares, pode-se utilizar o conceito de capacidade de campo, sendo recomendável que a umidade esteja próxima, mas abaixo da capacidade de campo.

Normalmente, usa-se temperatura constante de 23 ºC para a condução dos ensaios de virulência de Neps contra insetos, em laboratório.

Inoculação

Antes da inoculação, os nematoides devem ficar por 24 horas à temperatura escolhida para condução do ensaio. Os JIs devem ter, no máximo, 30 dias após a multiplicação, sendo preferível usá-los com menos de 15 dias. O período de tempo transcorrido entre a obtenção dos JIs e a aplicação dos mesmos deve ser explicitado na descrição dos materiais e métodos do ensaio.

A aplicação do inóculo pode ser feita diretamente no inseto e no papel, homogeneamente na areia ou no solo, ou aplicada sob ou sobre a superfície de areia ou de solo. Este último é o modo preferível, pois é o mais utilizado a campo. Em todos os casos, deve-se repetir a homogeneização dos Neps na suspensão a cada inoculação de parcela. Deve-se, também, colocar água na testemunha em volume correspondente ao aplicado nas parcelas dos tratamentos, usando água de mesma procedência. A quantidade de nematoides a ser usada não é pré-definida, mas é comum o uso de 100 JIs por larva de inseto, podendo-se chegar a 1000 ou mais por inseto mais resistente aos Neps. De qualquer modo, após determinar-se que existe virulência do isolado de Nep contra o inseto em estudo, deve-se estudar a dose-resposta, em busca de quantidade economicamente factível para inocular, a campo.

Cuidados com os insetos

Os insetos devem ficar à temperatura do ensaio por um a dois dias antes da instalação do mesmo.

Deve-se ter cuidados com o vigor dos insetos a serem utilizados nos ensaios. Insetos estressados por falta de comida ou manutenção imediatamente precedente à instalação do ensaio podem produzir resultados peculiares e pouco representativos. Quando em fases móveis, uma forma de evitar o emprego de insetos debilitados é colocá-los sobre o solo ou areia e deixar penetrar nesse substrato. Os que não conseguirem adentrar o substrato são descartados. Deve-se colocar alimento nas parcelas para os insetos em fase ativa (Fig. 19).

A fase do inseto deve ser homogênea e definida, com a ajuda de especialista. É recomendável obter-se medidas do inseto, seja de comprimento, de peso, ou ambos. A perda de peso é um dos parâmetros usados para definir a efetividade de agentes de controle de insetos, indicando problemas alimentares induzidos pelo agente usado. Por outro lado, insetos de tamanhos diferentes, embora dentro de mesma fase do ciclo, podem apresentar respostas diferentes aos Neps.

Avaliações

A variável avaliada nos testes de virulência de Neps é a da mortalidade dos insetos. Outros parâmetros são selecionados conforme o objetivo do estudo, como capacidade reprodutiva, distância de deslocamento no solo, tempo de sobrevivência, etc.

As observações de mortalidade ou de alterações provocadas nos insetos pelos Neps devem ser feitas periodicamente, conforme a espécie. Verificações diárias ou a cada três dias são indicadas no caso de insetos mais sensíveis aos Neps, ou com resposta desconhecida. Insetos mais resistentes, como no caso de larvas de Scarabaeidae (corós), devem ser vistoriados a cada semana, por períodos de um mês. Ao morrer por ataque de Neps, alguns insetos podem mostrar coloração diferente, facilitando a atribuição da morte ao agente. Insetos mortos por Heterorhabditis x Photorhabdus apresentam coloração inicial avermelhada, tornando-se marrom, em seguida (Fig. 20). Insetos mortos por Steinernema x Xenorhabdus podem ficar com um tom de marrom mais claro do que os mortos por Heterorhabditis (como no caso do T. molitor), mas geralmente ficam mais escurecidos (como no caso de G. mellonella) ou amarelados.

Os resultados da mortalidade dos insetos normalmente são apresentados e analisados como porcentagem, após correção da mortalidade da testemunha com a fórmula de Abbott (1925), que desconta a mortalidade da testemunha. Por isso, um número grande de insetos para cada parcela (geralmente dez) é indicado. Insetos canibais ou agressivos devem ser colocados isoladamente, somando-se aos outros para a formação da parcela. Para análise estatística, as porcentagens são transformadas em arcoseno.

O número de insetos mortos no tratamento, subtraído do número de insetos mortos na testemunha, pode ser considerado como resultante do tratamento. Mas, eventualmente, há necessidade de se confirmar a presença de Neps ou sua multiplicação. No último caso, coloca-se o inseto morto em armadilha de White para se obter novos JIs, enquanto, no primeiro caso, pode-se abrir o inseto e verificar a presença de Neps sob lupa. Para evitar o processo trabalhoso de dissecação dos insetos, podem ser usadas enzimas para decompor os tecidos do inseto. A pepsina a 8% (Anexo), em agitador a 120 rpm, leva pouco mais de 1 hora a 37 ºC para desfazer os tecidos do inseto previamente dissecado. Após a digestão, as placas podem ser guardadas em geladeira por vários dias enquanto não são contadas.

Documentos Online Nº 119 Publicações Online

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