Dezembro, 2009	119
		Passo Fundo, RS

O método mais comum para isolar Neps baseia-se na técnica do inseto-armadilha ou inseto-isca, sendo os métodos diretos de extração limitados aos pesquisadores especializados em taxonomia. A obtenção de nematoides é favorecida pela escolha do local de coleta de solo onde haja abundante entomofauna de solo e pela repetição do processo de inseto-armadilha em amostras negativas, pois os juvenis infectivos (JIs) podem permanecer não infectantes durante algum período. Por outro lado, mesmo que não se obtenham nematoides de amostra de solo de um local, não significa que não haja nematoides, pois a infecção do inseto armadilha pode ser dificultada por baixa sensibilidade a determinado nematoide e pela baixa população dos Neps ou distribuição agregada (falso negativo) (HOMINICK, 2002).

Basicamente, o isolamento de Neps pode ter dois objetivos distintos. Estudos exploratórios visam à obtenção de novos isolados de Neps, sendo que as amostragens devem ser conduzidas preferencialmente nas estações do ano com maior abundância de insetos (primavera-verão), aumentando, dessa forma, a chance de sucesso. Por outro lado, quando se deseja conhecer a dinâmica populacional de determinada espécie/isolado de Nep nativo ou exótico (aplicado ou de ocorrência natural) em um ecossistema restrito, as amostragens devem ser tomadas sistematicamente ao longo do período de estudo.

Coleta de solo

Amostras de solo são extraídas a uma profundidade entre 0 a 10 cm, com auxílio de trado, num raio de 5 m, sendo cada ponto da amostra constituído de 5-10 sub-amostras de solo, de cerca de 100 gramas cada. As sub-amostras são misturadas em baldes, acondicionadas em sacos plásticos e transportadas ao laboratório (modificado de KAYA & STOCK, 1997). A identificação das amostras deve permitir a recuperação do ponto de amostragem, e também permitir conotações com o habitat associado (altitude, temperatura predominante e tipo de vegetação) (Fig. 5). O uso de GPS é recomendável. Entre um ponto amostrado e outro, os equipamentos devem ser limpos com álcool 70% ou solução de hipoclorito 0,5%, a fim de evitar contaminação entre amostras.

Coleta de insetos contaminados

De forma geral, para isolamento de Neps em insetos infectados no campo, podem ser utilizadas todas as técnicas de coleta de insetos, exceto aquelas que utilizam etanol ou detergente.

Obtenção de nematoides entomopatogênicos

Técnica do inseto-armadilha

Para o isolamento de Neps a partir do solo, utilizando a técnica do inseto-armadilha, o solo de cada amostra obtida no campo deve, inicialmente, ser umedecido com água destilada (quando necessário), para atingir umidade próxima e inferior à da capacidade de campo. De acordo com a metodologia modificada de Bedding & Akhurst (1975), cada amostra pode ser mantida em recipientes plásticos nos quais são colocadas dez lagartas de Galleria mellonella (L.) do último ínstar, ou de Tenebrio molitor, sob o solo, de forma que as lagartas fiquem em contato com o substrato (Fig. 6). Estes frascos devem ser mantidos em temperatura de 25 ± 3 ºC.

Após cinco a sete dias, os insetos mortos e com sintomas de infecção por Neps devem ser desinfestados superficialmente com solução de hipoclorito de sódio a 0,1%, colocados em câmara seca (placa de Petri de 9 cm de diâmetro com papel de filtro) e incubados em câmara climatizada a 23-25 ºC. Após três dias, os cadáveres devem ser transferidos para armadilhas de White (WHITE, 1927) para a coleta dos JIs (Fig. 7).

A armadilha inventada por White (1927) consiste em uma placa de Petri em cuja base se acondiciona um suporte que é recoberto com papel filtro ou papel germiteste. Adiciona-se água deionizada ou com baixo teor de cloro para cobrir o fundo da placa e apenas umedecer o papel. Sobre o papel, coloca-se uma ou mais larvas do inseto contaminado. Após 10 a 15 dias os JIs deslocam-se do inseto para a água, pela ponte de papel, enquanto que os indivíduos adultos ou de outras fases larvais permanecem no inseto. Pode-se recolher JIs por cerca de 15 dias, mas é recomendável não prolongar a coleta por mais de uma semana, para evitar contaminações por microorganismos ou coletar nematoides menos vigorosos.

Os JIs coletados devem ser purificados conforme descrição feita no item Purificação. Parte da suspensão obtida é usada para confirmação de virulência em T. molitor ou G. mellonella, para atender aos postulados de Koch, e parte é conservada em geladeira a 10-15 ºC, em recipientes contendo lâmina d’água inferior a 3 mm, para facilitar a troca gasosa, evitando anoxia (vide item Câmara com temperatura controlada).

O mesmo procedimento deve ser aplicado com insetos mortos oriundos de coleta de campo.

Técnicas de obtenção direta

Outras técnicas são as de obtenção direta de JI a partir do solo, com o emprego de funil de Baermann, ou peneiramento-gravidade, ou elutriação ou a técnica de centrifugação-flotação (KAYA & STOCK, 1997). Essas técnicas não serão abordadas neste manual.

Documentos Online Nº 119 Publicações Online

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